Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
В определении могут использоваться, например, инкубационные пробирки, температура которых поддерживается с помощью водяной бани на уровне 370С. В каждую пробирку помещают по 0,1 мл субстрата плазмы R2 и по 0,1 мл одного из разведений испытуемого препарата или препарата сравнения. К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,1 мл подходящего разведения цефалина R или заменителя тромбоцитов R и 0,1 мл суспензии 0,5 г легкого каолина R в 100 мл раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Пробирки выдерживают около 10 минут, время от времени переворачивая. К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,1 мл раствора кальция хлорида R концентрацией 7,4 г/л. С использованием секундомера измеряют время коагуляции, т.е. интервал времени между добавлением хлорида кальция и первыми признаками образования фибрина, которые можно определять либо визуально, либо с применением соответствующей аппаратуры. Вычисляют активность с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).
Для подтверждения отсутствия в субстрате плазмы R2 существенного количества фактора IX выполняют контрольный опыт с использованием вместо испытуемого препарата соответствующего количества смеси 1 объема раствора натрия цитрата R концентрацией 38 г/л и 5 объемов имидазольного буферного раствора рН 7,3 R. Результаты испытания считают достоверными, если время коагуляции в контрольном опыте составляет от 100 до 200 секунд.
2.7.12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕПАРИНА В КОНЦЕНТРАТАХ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Гепарин определяют в виде комплекса с антитромбином III (АТ) по его способности к ингибированию фактора свертывания крови Ха (анти-Ха активность). В реакционной смеси поддерживают избыток АТ для обеспечения постоянной
концентрации комплекса гепарина с АТ. Фактор Ха нейтрализуется комплексом гепарина с АТ, а его избыток гидролизует специфический хромофорный пептидный субстрат с высвобождением хромофора. Количество хромофора обратно пропорционально активности гепарина.
Хромогенный субстрат фактора Ха. Специфический хромогенный субстрат для фактора Ха, например Ы-бензоил^-изолейцил^-глутамил-глицил^-аргинина 4-нитроанилида гидрохлорид. Субстрат восстанавливают в соответствии с указаниями изготовителя.
Буфер для разведений. Раствор трис-(гидроксиметил)-аминометана R концентрацией 6,05 г/л. При необходимости доводят значение рН до 8,4 добавлением хлористоводородной кислоты R.
Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для разведений, получая раствор с ожидаемым содержанием 0,1 МЕ/мл.
Стандартный раствор. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с ожидаемым содержанием 0,1 МЕ/мл.
Нижеописанные условия определения относятся к титрационным микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.
Перед началом испытания все растворы быстро нагревают на водяной бане до 370С.
В ряд ячеек распределяют по 20 мкл нормальной человеческой плазмы и по 20 мкл раствора антитромбина III R1. Добавляют в ячейки ряда 20, 60, 100 и 140 мкл испытуемого или стандартного раствора и доводят объемы в каждой из ячеек до 200 мкл с использованием буфера для разведений (содержание гепарина в конечной смеси 0,02-0,08 МЕ/мл).
Метод конечной точки. По 40 мл содержимого каждой из ячеек переносят во второй ряд ячеек, добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Ха R и инкубируют при 370С в течение 30 секунд. Добавляют по 40 мкл раствора хромогенного субстрата фактора Ха концентрацией 1 ммоль/л и инкубируют при 370С в течение 3 минут. Реакцию прерывают путем снижения показателя рН добавлением походящего реагента, например, раствора ледяной уксусной кислоты R концентрацией 20 объемных процентов, и определяют оптическую плотность при длине волны 405 нм (2.2.25). Обычно подходящей является продолжительность реакции от 3 до 15 минут, но допускаются отклонения от этого интервала при условии получения лучшей линейности зависимости отклика от дозы.
Кинетический метод. По 40 мл содержимого каждой из ячеек переносят во второй ряд ячеек, добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Ха R и инкубируют при 370С в течение 30 секунд. Добавляют по 40 мкл раствора хромогенного субстрата фактора Ха концентрацией 2 ммоль/л, инкубируют при 370С и регистрируют скорость расщепления субстрата путем постоянного измерения оптической плотности при длине волны 405 нм (2.2.25), определяя таким образом начальную скорость расщепления субстрата. Это значение должно находиться в линейной зависимости от остаточной концентрации фактора Ха.
Проверяют достоверность определения и вычисляют активность гепарина в испытуемом препарате с использованием обычных статистических методов, подходящих для анализа результатов измерения углов наклона (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).
